Bagnaia, en su decimonovena y última vuelta rodó en 1:46.147, con lo que aventajó en 71 milésimas de segundo al español Alex Rins (Suzuki GSX RR), quien apenas una vuelta antes había logrado el mejor registro de la categoría, con el italiano Franco Morbidelli (Yamaha YZR M 1) tercero y el francés Fabio Quartararo (Yamaha YZR M 1), cuarto, en tanto que su compañero de equipo, el español Maverick Viñales, que había sido el más rápido por la mañana, se tuvo que conformar con la octava posición del primer día.
La primera gran sorpresa de la segunda tanda libre llegó de la mano del portugués Miguel Oliveira y su KTM RC 16, que por la mañana acabo décimo con 1:47.5, y en apenas cuatro vueltas por la tarde ya se había colocado líder al rodar 1,2 segundos más rápido para marcar un 1:46.584, quizás debido en gran medida a que por la mañana apenas cambió de neumáticos y siempre utilizó un compuesto intermedio detrás y un nuevo compuesto más duro, delante.
Otra de las sorpresas la protagonizó el propio Valentino Rossi (Yamaha YZR M 1), quien en la frenada de San Donato, a final de la larga recta, entró "colado" y se tuvo que ir recto a la grava para evitar la caída, si bien por entonces sus registros no resultaban demasiado significativos.
Oliveira se mantuvo líder durante buena parte de la sesión con ese tiempo, en tanto que por detrás comenzaron a aproximarse sus competidores, como el italiano Francesco "Pecco" Bagnaia (Ducati Desmosedici GP21) y el español Alex Rins (Suzuki GSX RR), que dispone como Joan Mir de un nuevo dispositivo de salida en una de sus motos y que al menos al primero se le vio utilizar en la larga recta de Mugello.
No se vio a Marc Márquez demasiado fuerte, más bien sufriendo en la pista de la Toscana, que es muy física, y eso se tradujo en unos registros bastante "pobres" casi durante toda la sesión.
En los minutos finales comenzaron a producirse los cambios más importantes, el primero de ellos protagonizado por Alex Rins, que con el nuevo dispositivo en su Suzuki rodó en 1:46.218, secundado por el surafricano Brad Binder (KTM RC 16), que superó por 64 milésimas de segundo a su compañero de equipo Oliveira, si bien a ambos los superó el francés Quartararo, 1:46.372, a 154 milésimas de segundo del español de Suzuki.
A Quartararo no le duró mucho la alegría pues por detrás de él su ex-compañero de equipo, el italiano Franco Morbidelli (Yamaha YZR M 1) paró el crono en 1:46.372, si bien al francés le quedaba una vuelta más, pero en ella no pudo doblegar al transalpino.
Quien si lo hizo fue el anterior líder del mundial, el "local" "Pecco" Bagnaia, que en su última vuelta se colocó líder con un tiempo de 1:46.167, doblegando a Rins y Morbidelli, y con un Marc Márquez que pudo mejorar "algo" para acabar duodécimo la jornada, fuera de la segunda clasificación directa, por apenas 133 milésimas de segundo respecto al décimo, que fue el francés Johann Zarco (Ducati Desmosedici GP21).
Si se metió en la segunda clasificación Aleix Espargaró (Aprilia RS-GP), que acabó octavo, por detrás de Miguel Oliveira y el japonés Takaaki Nakagami (Honda RC 213 V) y por delante del australiano Jack Miller (Ducati Desmosedici GP21) y el propio Johann Zarco.